Estudio del corte proteolítico y cambio conformacional de la hélice α-1 y α2 del dominio I de la toxina Cry1Ab de Bacillus thuringiensis en la oligomerización in-vitro en Manduca sexta (Gusano cornudo)

Abstract

Objetivo: Determinar de qué manera el corte proteolítico y cambio conformacional de la hélice α-1 y α-2 del dominio I de la toxina Cry1Ab de Bacillus thuringiensis influirán en la oligomerización in-vitro en Manduca sexta. Materiales y métodos: En el diseño experimental se generó mutantes dobles con cisteínas para establecer puentes disulfuro entre la hélice α-1 y α-7 (Cry1Ab S39C-T239C) para estudiar el corte proteolítico en la oligomerización; y la mutante Cry1Ab D74C-R93C, la cual establece un puente disulfuro entre la hélice α-2b y α-3, con el propósito de estudiar el cambio conformacional en la oligomerización, dicho análisis se realizó en condiciones in-vitro en presencia de BBMV y fragmentos de caderina CR7-CR12, se visualizó por Western blot. Por otra parte, también se generó la mutante Cry1Ab S39C para analizar el desprendimiento de la hélice α-1 por medio de FRET en el monómero y oligómero, el análisis de oligomerización se realizó como se mencionó anteriormente, por último, se realizó bioensayos con larvas de Manduca sexta con las mutantes que se generaron y se determinó la concentración letal media (CL50) con el programa LdP Line. Resultados: Las mutantes Cry1Ab S39C-T239C y Cry1Ab D74CR93C en el análisis de oligomerización se observó complejos proteícos de 180-200 kDa que corresponden al oligómero de la toxina Cry1Ab en presencia de BBMV o con el fragmento de caderina CR7-CR12. Con respecto a los ensayos de FRET con la mutante Cry1Ab S39C la presencia de BBMV o CR7-12 mostraron un FRET (+) comparable a la toxina monomérica. En los bioensayos con larvas de M. sexta la CL50 (ng/cm2) de la toxina Cry1Ab es 1.81, Cry1Ab S39C es 0.93 Cry1Ab S39C-T239C es 0.86 y Cry1Ab D74CR93C es 17.52. Conclusiones: El análisis de oligomerización de la mutante Cry1Ab S39CT239C, junto con los estudios de FRET con la mutante Cry1Ab S39C muestran que una vez que se lleve a cabo el corte proteolítico entre la hélice α-2a y α-2b, no es necesario la separación de la hélice α-1 y α-2a para formar el oligómero de la toxina Cry1Ab. La mutante Cry1Ab D74C-R93C mostró que probablemente el cambio conformacional de la hélice α2b, no es necesario para formar el oligómero. Las mutantes Cry1Ab S39C y Cry1Ab S39CT239C presentan ser más toxicas que la Cry1Ab